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Mas como reconhecer a posição dos fragmentos? Para isso, é preciso lançar mão de uma “sonda”, isto é, um pequeno fragmento de DNA marcado com isótopo radioativo ou com um radical que emite luz sob certas condições. Sendo também um fragmento de DNA, a sonda contém uma seqüência que complementa apenas um tipo de seqüência invariável já conhecida presente no fragmento em estudo, o que permitirá a ligação de ambos.
Com o uso de filme fotográfico, descobre-se a posição da sonda e, portanto, do fragmento. No caso dos sítios unilocais - que só ocorrem uma vez no genoma inteiro -, existem sempre dois “alelos”, pois as células (exceto as reprodutivas) têm um par de cada cromossomo. Como os alelos têm a mesma seqüência básica e tamanhos distintos, uma sonda complementar a essa seqüência se ligará a ambos e eles aparecerão em posições diferentes no filme fotográfico. Todas as pessoas recebem um desses alelos da mãe e outro do pai.
Portanto, no teste de paternidade, basta comparar os alelos da mãe, de seu filho(a) e do suposto pai, e a coincidência do alelo paterno do filho com um alelo do suposto pai confirmará a paternidade “biológica”. Quando se quer investigar apenas a identidade de uma pessoa (um criminoso, por exemplo), é preciso comparar o padrão de polimorfismo de amostras de DNA obtidas na cena do crime com os padrões de vários suspeitos.
Síntese de fragmentos de DNA
Para detecção do polimorfismo, são usados iniciadores que flanqueiam regiões do DNA onde existem repetições de nucleotídeos (em grupos de dois, três ou mais). Isso significa que tais iniciadores delimitam a síntese das novas cadeias ao trecho com as repetições, situado entre os sítios aos quais eles se ligam. Tais repetições são chamadas de STR (do inglês Short Tandem Repeats, ou “repetições curtas em série”), e as regiões onde se encontram são conhecidas como “microssatélites”.
DNA mitocondrial
Além do DNA genômico, presente no núcleo das células, também há DNA nas mitocôndrias, organelas situadas no citoplasma. Esse DNA é muito menor que o nuclear e tem estrutura circular, que o torna mais parecido com o das bactérias.
No contexto da análise forense, o interesse pelo DNA mitocondrial surgiu por vários motivos: primeiro esse DNA também contém regiões polimórficas que permitem sua individualização; segundo, os descendentes recebem esse DNA apenas da mãe, o que permite traçar a linhagem materna de uma pessoa; e terceiro, esse DNA é mais resistente à degradação que o DNA nuclear. Assim, em grandes desastres (incêndios, explosões, queda de avião, etc.), quando é mais difícil identificar os corpos, analisa-se o DNA mitocondrial. Este é extraído dos restos mortais e a seqüência de interesse é comparada com seqüências obtidas de irmãos ou ascendentes maternos.
Grau de confiança do teste de DNA
Um ponto que tem gerado intensa discussão entre laboratórios e agências de teste de DNA é o número de locos polimórficos necessários para estabelecer de modo confiável a identidade e a paternidade. O índice utilizado para as conclusões, tanto sobre a identidade de uma pessoa como sobre a paternidade, depende do número de locos analisados. Para chegar a um índice adequado, porém, é preciso levar em conta a freqüência dos alelos na população: se eles forem muito comuns, os resultados das análises serão no mínimo duvidosos.
Os grupos sangüíneos (A, B, O e AB) podem ser utilizados como exemplo. Tais grupos, que dependem da combinação de alelos, distribui-se nas populações do mundo com freqüências conhecidas. Na Alemanha, 46% a 48% têm sangue tipo A. Já na Eurásia Central, Índia, Mongólia e Sibéria, prevalecem o tipo B. Em nenhuma dessas regiões, portanto, esses grupos sangüíneos poderiam ser usados isoladamente para identificar um indivíduo, porque um grande percentual da população teria um ou outro. É importante que os alelos investigados sejam raros.
No caso dos polimorfismos de DNA (RFLPs), as freqüências são bem menores. Para exemplificar, vamos imaginar uma disputa de paternidade no Rio de Janeiro em que o loco D10S28 seja usado como sonda, permitindo obter, no suposto pai, um alelo que ocorre em aproximadamente 2,8% da população carioca. Esse valor é muito alto se considerarmos que a população da cidade é de cerca de 8 milhões de habitantes. Para reduzir esse valor, é preciso pesquisar outros locos no mesmo indivíduo. Imaginemos que uma segunda análise, usando o loco D2S44, tenha revelado um alelo com freqüência de 7,28%, percentual que indica a existência de 582.000 pessoas no Rio de Janeiro com este alelo.
Mas quantos indivíduos teriam os dois alelos? Apenas 16.307. Tal número é obtido através da multiplicação do inverso das duas freqüências: 2,8/100 x 7,28/100 x 8 milhões. Usando mais um loco, a análise indicará outra freqüência, permitindo reduzir ainda mais o percentual. Na prática, o uso de cinco a sete sondas gera um valor baixo o suficiente para que o resultado seja conclusivo.