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Após o governo de Tomé de Sousa, Portugal se deparava com um grave problema no Rio de Janeiro. A invasão dos franceses e sua aliança com os índios da região tomava uma proporção significativa, se tornando uma ameaça ao domínio português. A principal realização do terceiro governador-geral do Brasil, Mem de Sá, foi justamente a expulsão dos franceses e o controle da situação.
Mem de Sá assumiu o governo da colônia em 1558 e continuou governando por 15 anos. A primeira coisa que fez foi contornar a situação da invasão francesa. Num primeiro ataque, Mem de Sá conseguiu destruir o forte Coligny, no entanto não foi suficiente para vencer a disputa. Assim, em 1º de março de 1565, o sobrinho de Mem de Sá, Estácio de Sá, fundou a cidade de São Sebastião, que passou a ser a base das operações da luta contra os franceses. O desfecho do caso se deu somente com a ajuda de tropas do governador e da região de São Vicente e dos índios temiminós do Espírito Santo, onde foi possível expulsar os estrangeiros definitivamente.
Em 1563, os jesuítas José de Anchieta e Manuel de Nóbrega conseguiram firmar a paz entre os índios tamoios e os portugueses, a chamada Paz de Iperoig. O fim do conflito entre os índios tamoios e os portugueses foi importante para permitir a sobrevivência do Colégio de São Paulo e a permanência dos colonizadores na região.
Embora Mem de Sá tenha convivido com sérios problemas, como a fome e a varíola na Bahia, seu governo foi marcado por uma relativa paz e prosperidade. Em 1572, Mem de Sá resolveu deixar o governo-geral e voltar para Portugal. No mesmo ano, faleceu. Após sua morte, o Brasil foi dividido em dois governos: o do Norte, com sede em Salvador, e o do Sul, com sede no Rio de Janeiro.